色谱工作者常会碰到这样的问题，色谱柱的塔板数能体现色谱柱的状态吗？如何确定一支色谱柱是否应该“退休”？新的色谱柱在使用前都要做什么？如何对柱子进行清洗？好的色谱柱应具备哪些性能？等等一系列问题，都是今天小萃要和您探讨的。

　　新色谱柱开启和安装推荐步骤

　　1.使用新鲜洁净的水与乙腈。冲洗系统，确保系统干净，不含任何缓冲盐和污染物。

　　2.取用色谱柱时避免磕碰掉落。

　　3.将色谱柱入口端连接到系统上，柱出口端先不要连接，色谱柱身上有箭头标明正确流向。

　　4.在0.1mL/min流速条件下用纯乙腈润洗色谱柱，然后在2分钟内将流速升至0.5mL/min。

　　5.当溶剂均匀的从柱出口端流出，停流速，将色谱柱出口端接到系统检测器上（这样可以避免气泡进入检测系统，并且可快速达到基线平衡）。

　　6.重启流速，按照步骤4的方法逐渐提高流速，至常规分析时所使用的流速。

　　7.参考柱效测试报告中的方法，使用该流动相条件平衡色谱柱，通常需要使用5-10倍柱体积的流动相，直至压力与基线稳定。

　　8.测试柱效。如果没有柱效测试报告中的分析物，请联系厂家部门寻求支持，使用合适的浓度与进样量。柱效结果略低于柱效测试报告属正常情况。如结果明显偏低、峰形拖尾，提示色谱柱和/或所使用的液相系统处于非理想状态，需要进行故障排查。当使用2.1mm内径色谱柱时，建议优化系统以减少谱带展宽，包括：使用检测器微量流通池，减少进样器loop环体积，使用较小内径（如0.005‘‘或0.12mm）的系统管路。并确保管路与色谱柱连接恰当、无死体积。当使用小颗粒填料（如2.5μm）短柱进行高效快速分离时，

　　需要考虑以下因素：

　　1.确保管路与色谱柱连接恰当、无死体积，尽量优化系统减少谱带展宽；

　　2.提高采样频率至10点/秒以上；

　　3.较小粒径的色谱柱产生的柱压较高，而较小粒径要达到最优色谱效率所需的线速度较高，请根据所用LC系统的实际情况调节流速；

　　4.可使用较高的柱温来补偿小颗粒造成的压力升高，例如40℃。使用杂化颗粒反相色谱柱时，可使用45℃或更高。

　　使用反相C18色谱柱总结的一些小经验

　　1、新柱的处理：

　　我们每次新买的柱子虽然是经厂家测试过并密封好的，可是有的柱子到达手中时已经过很长的时间了，因此，我们每拿到一根新的色谱柱都必须要对柱子进行处理。首先，是配制好65%的乙腈/水，再把色谱柱正确的连接在色谱仪上，出口放空（注意：出口端切不可连上检测器，以免污染了检测器），以低流速0.1ml/min-0.5ml/min（如果是LC/MC柱子，则应以0.3ml/min进行）均可，不可以高流速进行，等看见柱子出口有液体流出后，过20分钟后再接上检测器，以循序渐进的方法将流速调至1.0ml/min（如果是LC/MC柱子则应以0.3ml/min进行），继续冲洗2-8小时。

　　2、新柱的使用：

　　首先我们确认所分析样品流动相的PH是不是在色谱柱PH的耐受范围之内，以免损伤柱子！如果，确认在柱子的使用范围之内，就用做样品的流动相平衡柱子(如果流动相中含用缓冲盐溶液，在平衡柱子之前务必要先用5%甲醇或5%乙腈去过渡30分钟以上。再用带盐的流动相去平衡色谱柱。)当色谱柱平衡了足够时间，基线非常平稳的时候，方可进样分析。不管是分析什么样的产品，由于各种各样的因素，样品中总有杂质。因此，最好在色谱柱前端加上保护柱。以增加色谱柱的使用寿命！

　　3、色谱柱清洗：

　　①如果样品分析中只用到一般的乙腈、甲醇和水的流动相，在做完样品之后可直接用55%-65%乙腈/水或者用55%-65%甲醇/水冲洗色谱柱40-80分钟，然后以纯甲醇或乙腈冲洗30分钟，即可保存；②如果样品分中流动相里含用缓冲液或酸或离子对试剂的流动相，在做完样品之后的清洗必须按照如下步骤进行清洗柱子:先用5%的甲醇/水或5%的乙腈/水，以1ml/min,冲洗1.5小时以上(如果色谱柱更长，则还需要增加适当时间)；然后用55%甲醇/水-65%/水冲洗色谱柱30-60分钟.最后用甲醇或乙腈以1ml/min冲洗30分钟。

　　4、色谱柱的再生：

　　当色谱柱用过很长的时间之后，就可能发生柱压力升高、分离度不好、柱效降低、峰形不好等等情况，这时我样就需要对色谱柱进行再生，以延长色谱柱的使用寿命。具体方法有如下两种：先用5%甲醇/水或者是5%乙腈/水，把色谱柱反向以1ml/min，冲洗60分钟以上。然后用四氢呋喃以1ml/min冲洗30分钟以上；再用65%甲醇/水或者65乙腈/水，以流速1ml/min冲洗60分钟。最后用纯甲醇或乙腈冲洗30分钟保存即可。备注：甲醇、乙腈、四氢呋喃均要用质量好色谱纯。水用是重蒸馏水。

　　什么时候该换新柱了？

　　1.当柱子塔板数降低到新柱子百分之几时该换？

　　色谱工作者常会碰到这样的问题，什么时候该换色谱柱了？色谱柱的塔板数能体现色谱柱的状态吗？确定表明一支色谱柱应该“退休”的标准，从经验来看，当一支色谱柱的塔板数降低到新柱子时的百分之多少时就可以认为该色谱柱不能再使用了呢？将塔板数作为评价色谱柱质量的唯一指标合适吗？在您的实验室里是如何判断一根色谱柱不可以再用了呢？

　　塔板数是一个粗略的指标，不能作为评价色谱柱的标准。通常使用塔板数来考察色谱系统：将新柱子接到仪器上，根据色谱柱生产商提供的测试条件测试该色谱柱，你应该得到和分析报告上同样的结果。最差也应该得到比报告值低10%的塔板数。如果你所测得的塔板数远远低于厂家提供的报告数据，这就说明你的色谱系统可能存在一些问题。进样器、柱外效应、毛细连接以及检测器都是容易出现问题的地方。

　　2.使用压力、分辨率和峰形的混合指标来考察一根色谱柱的状态

　　相信每个色谱工作者都会关心分辨率，分辨率是考察一根色谱柱分离具体样品的好坏程度指标。然而，我们需要考虑的另一个因素是塔板数对分辨率的影响仅仅是平方根的关系，这意味着当一根色谱柱的塔板数下降50%，分辨率仅仅下降7%。而当一根色谱柱塔板数下降为新柱子一半的时候，你肯定看到了其它更加严重的症状告诉你这根色谱柱的寿命不长了。在实际的工作中，大多数色谱方法仅仅需要这些塔板数的一半，这些色谱方法还有优化的空间吗?答案是肯定的。可见，色谱柱的塔板数不是分离中最重要的参数。较好的方法是使用压力、分辨率和峰形的混合指标来考察一根色谱柱的状态。

　　（1）压力的测量：通常我们确定的色谱方法要满足以下的要求。用新柱子时柱压不高于2500psi，在任何情况下压力都不超过3000psi。尽管现代的液相色谱系统都可在更高的压力下使用，但由于高压产生的系统损耗和泄漏的问题会很严重。当压力超过3000psi时，考虑更换进样器和色谱柱之间的0.5mm孔径的在线滤片。如果更换滤片后压力仍然高，则色谱柱的滤片或者是色谱柱已经被污染，这提示我们该换柱子了。有统计表明，超过60%的色谱柱损坏是由于压力过高的原因。

　　（2）分辨率：是我们考察色谱柱的一个非常重要的指标，只要两个组分可以获得基线分离，对该分析物的定量就不会有什么问题。对于对称的高斯峰来讲，1.5的分辨率即可得到基线分离；若Rs在1.7至2.0之间则更好。若峰拖尾严重则需要更高的分辨率。使用分辨率作为色谱柱的评价指标的好处在于我们可以直观地看到相邻的峰的分离情况。

　　（3）峰形拖尾：另:一个考察色谱柱质量的标准是峰形拖尾情况，厂家测试报告的峰形都非常漂亮，但这并不代表该色谱柱分析实际样品的情况。实际样品中总是含有或多或少引起峰形拖尾的组分。最值得一提的是含有氮原子的化合物，这些化合物和硅胶骨架上的游离硅羟基结合非常紧密，随着色谱柱使用时间越长，键合相流失，拖尾则更加严重。然而拖尾情况的改变不像分辨率的改变那样能够马上看出来。基于此，最好定一个拖尾因子的上限，如美国药典规定拖尾因子不超过1.8。

　　3.确定色谱柱“抛弃”标准最佳时间

　　确定色谱柱“抛弃”标准的最佳时间是当我们开发分析方法或作方法认证的时候。通常，在开发分析方法的过程中你会试验几根色谱柱，分析足够多的实际样品，你知道当分离变差的时候是什么样的情况。我倾向于在开始时使用一个宽的范围。我们的经验是这样的：你如果在开始时紧缩系统适用性要求，在方法认证后再放宽这个要求是很困难的。在分析实际样品之前进行系统适用性考察，以确保该色谱方法满足分析者可以接受的标准。

网友经验谈：新买的C18色谱柱用前该如何处理？

　　首先用甲醇或乙腈冲洗，大约20倍柱体积，除新柱子中的有机杂质。然后用10%甲醇或乙腈冲洗10倍柱体积（相比较而言，乙腈价格比甲醇贵，所以一般用甲醇冲洗，大约4小时就可以了）。进行流动相过度，然后就可以运行你的流动相体系了。用完之后，如果流动相中有缓冲盐，要用10%甲醇冲洗20倍柱体积，如果长期不用，保存在出场溶剂中，短期不用，不用处理，密封后柱子就OK了。

　　如果马上就用：（1）使用的流动相中有缓冲盐，需用一定百分比的甲醇（如：10%甲醇）冲洗半小时，进行流动相过度，然后就可以运行你的流动相体系了；（2）使用的流动相无缓冲盐，如甲醇-水（1:1），可直接换流动相，待基线平稳后可直接进样。

　　网友经验谈：新柱子要充分平衡

　　反相色谱柱在经过出厂测试后是保存在乙腈-水中的；由于色谱柱在储存或运输过程中固定相可能会干掉，影起键合相的空间结构发生变化。因此新柱子要充分平衡。

　　反相色谱柱的平衡方法：

　　1.以乙腈或甲醇（最好是色谱纯的）为流动相，流速：0.2mL/min 冲一夜(小流速过夜冲就行)。

　　2.流速改为0.8mL/min 冲上30min直到基线水平为止（正常流速冲）。

　　3.使用时替换成流动相冲基线平了就可以用了。

　　正相：改用正庚烷或正己烷。（同同反相）以上均为硅胶键合相色谱柱！